Хвала вам што сте посетили Натуре.цом. Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС. За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у). У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Термофили су микроорганизми који успевају на високим температурама. Њихово проучавање може пружити драгоцене информације о томе како се живот прилагођава екстремним условима. Међутим, тешко је постићи високе температурне услове са конвенционалним оптичким микроскопима. Предложено је неколико домаћих решења заснованих на локалном отпорном електричном грејању, али једноставног комерцијалног решења нема. У овом раду представљамо концепт ласерског загревања микроскопа преко видног поља микроскопа да бисмо обезбедили високе температуре за термофилне студије, а да притом очувају благо окружење корисника. Микрозагревање при умереном ласерском интензитету може се постићи коришћењем супстрата обложеног златним наночестицама као биокомпатибилног и ефикасног апсорбера светлости. Разматрани су могући ефекти конвекције флуида на микроскали, задржавања ћелија и центрифугалног термофоретског кретања. Метода је демонстрирана код две врсте: (и) Геобациллус стеаротхермопхилус, активна термофилна бактерија која се размножава на око 65°Ц, за коју смо приметили да клија, расте и плива под микроскалним загревањем; (ии) Тхиобациллус сп., оптимално хипертермофилна археја. на 80°Ц. Овај рад утире пут за једноставно и безбедно посматрање термофилних микроорганизама коришћењем савремених и приступачних микроскопских алата.
Током милијарди година, живот на Земљи је еволуирао како би се прилагодио широком спектру услова животне средине који се понекад сматрају екстремним из наше људске перспективе. Конкретно, неки термофилни микроорганизми (бактерије, археје, гљиве) који се називају термофили напредују у температурном опсегу од 45°Ц до 122°Ц1, 2, 3, 4. Термофили живе у различитим екосистемима, као што су хидротермални отвори дубоког мора, топли извори или вулканске области. Њихово истраживање изазвало је велико интересовање у последњих неколико деценија из најмање два разлога. Прво, од њих можемо научити, на пример, како су термофили 5, 6, ензими 7, 8 и мембране 9 стабилни на тако високим температурама, или како термофили могу да издрже екстремне нивое зрачења10. Друго, они су основа за многе важне биотехнолошке примене1,11,12 као што су производња горива13,14,15,16, хемијска синтеза (дихидро, алкохоли, метан, аминокиселине, итд.)17, био рударство18 и термостабилни биокатализатори7,11, 13. Конкретно, тренутно добро позната ланчана реакција полимеразе (ПЦР)19 укључује ензим (Так полимераза) изолован из термофилне бактерије Тхермус акуатицус, једног од првих откривених термофила.
Међутим, проучавање термофила није лак задатак и не може се импровизовати ни у једној биолошкој лабораторији. Конкретно, живи термофили се не могу посматрати ин витро ни са једним стандардним светлосним микроскопом, чак ни са комерцијално доступним грејним коморама, обично оцењеним за температуре до 40°Ц. Од 1990-их, само неколико истраживачких група посветило се увођењу система високотемпературне микроскопије (ХТМ). Године 1994. Глукх ет ал. Комора за грејање/хлађење је замишљена на основу употребе Пелтиерове ћелије која контролише температуру правоугаоних капилара затворених да би се одржала анаеробност 20 . Уређај се може загрејати до 100 °Ц брзином од 2 °Ц/с, што омогућава ауторима да проучавају покретљивост хипертермофилне бактерије Тхермотога маритима21. Године 1999. Хорн ет ал. Развијен је веома сличан уређај, који се још увек заснива на употреби загрејаних капилара погодних за комерцијалну микроскопију за проучавање деобе/повезивања ћелија. Након дугог периода релативне неактивности, потрага за ефикасним ХТМ-има настављена је 2012. године, посебно у вези са серијом радова групе Виртх који су користили уређај који су измислили Хорн ет ал. Пре 15 година, покретљивост великог броја археја, укључујући хипертермофиле, проучавана је на температурама до 100°Ц коришћењем загрејаних капилара23,24. Они су такође модификовали оригинални микроскоп да би постигли брже загревање (неколико минута уместо 35 минута да би се постигла подешена температура) и постигли линеарни температурни градијент од више од 2 цм преко медијума. Овај уређај за обликовање температурног градијента (ТГФД) је коришћен за проучавање мобилности многих термофила унутар температурних градијената на биолошки релевантним растојањима 24, 25 .
Загревање затворених капилара није једини начин да се посматрају живи термофили. У 2012, Кувабара ет ал. Коришћене су домаће Пирек коморе за једнократну употребу запечаћене лепком отпорним на топлоту (Супер Кс2; Цемедине, Јапан). Узорци су постављени на комерцијално доступну провидну грејну плочу (Мицро Хеат Плате, Китазато Цорпоратион, Јапан) која је способна да се загреје до 110 ° Ц, али није првобитно била намењена за биоимаџинг. Аутори су уочили ефикасну поделу анаеробних термофилних бактерија (Тхермосипхо глобиформанс, време удвостручавања 24 мин) на 65°Ц. У 2020. Пулсхен ет ал. Ефикасно загревање комерцијалних металних посуда (АттофлуорТМ, Тхермофисхер) је демонстрирано коришћењем два домаћа грејна елемента: поклопца и степена (конфигурација инспирисана ПЦР машином). Ова асоцијација резултира уједначеном температуром течности и спречава испаравање и кондензацију на дну поклопца. Употреба О-прстена избегава размену гаса са околином. Овај ХТМ, назван Сулфоскоп, коришћен је за снимање Сулфолобус ацидоцалдариус на 75°Ц27.
Препознато ограничење свих ових система било је ограничење на употребу ваздушних објектива, при чему свако урањање у уље није погодно за тако високе температуре и за снимање кроз провидне узорке дебљине >1 мм. Препознато ограничење свих ових система било је ограничење на употребу ваздушних објектива, при чему свако урањање у уље није погодно за тако високе температуре и за снимање кроз провидне узорке дебљине >1 мм. Обсепризнанним недостатком всех етих системов било ограничено на использование воздушних объективов, с обзиром на свако имерсионное погружение в масло не подходило за такој високу температуру и за визуализациу через прозрачне образци толсиној > 1 мм. Препознати недостатак свих ових система било је ограничење употребе ваздушних објектива, пошто било какво урањање у уље није било погодно за тако високе температуре и за визуелизацију кроз провидне узорке дебљине > 1 мм.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜, 任何油浸都不适合认限制是限制使用空气物镜, 任何油浸都不适合蚿不适合连毫米厚的透明样品成像。 Препознато ограничење свих ових система је ограничење употребе огледала са ваздушним увлачењем, јер било какво урањање у уље није погодно за снимање провидних узорака дебљине >1 мм на тако високим температурама. Обсепризнанним недостатком всех ових система је ограничено коришћење ваздушних объектива, било какво имерсионно погружење у масло неприкладно за тако високу температуру и визуализацију кроз прозрачне образце дебљине >1 мм. Препознати недостатак свих ових система је ограничена употреба ваздушних сочива, свако урањање у уље је неприкладно за тако високе температуре и визуелизацију кроз провидне узорке дебљине >1 мм.Недавно су ово ограничење укинули Цхарлес-Орзаг ет ал. 28, који је развио уређај који више не обезбеђује топлоту око система од интереса, већ унутар самог покривног стакла, прекривеног танким провидним слојем отпорника од ИТО (индијум-калај оксид). Поклопац се може загрејати до 75 °Ц пропуштањем електричне струје кроз провидни слој. Међутим, аутор мора и да загреје сочиво до објектива, али не више од 65 °Ц, како га не би оштетио.
Ови радови показују да развој ефикасне високотемпературне оптичке микроскопије није широко прихваћен, да је често потребна опрема кућне израде, а да се често постиже по цену просторне резолуције, што је озбиљан недостатак с обзиром на то да термофилни микроорганизми нису већи од неколико микрометара. Смањена запремина грејања је кључ за решавање три инхерентна проблема ХТМ-а: лоша просторна резолуција, висока топлотна инерција када се систем загрева и штетно загревање околних елемената (уља за урањање, сочива објектива... или руку корисника) на екстремним температурама. ).
У овом раду представљамо ХТМ за посматрање термофила који није заснован на отпорном загревању. Уместо тога, постигли смо локализовано загревање унутар ограниченог региона видног поља микроскопа ласерским зрачењем супстрата који апсорбује светлост. Расподела температуре је визуелизована коришћењем квантитативне фазне микроскопије (КПМ). Ефикасност ове методе демонстрирају Геобациллус стеаротхермопхилус, покретна термофилна бактерија која се размножава на око 65°Ц и има кратко време удвостручења (око 20 минута), и Сулфолобус схибатае, хипертермофил који расте оптимално на 80°Ц (арцхаеа) да илуструје. Нормална брзина репликације и пливање примећени су као функција температуре. Овај ласер ХТМ (ЛА-ХТМ) није ограничен дебљином покровног стакла или природом објектива (урањање у ваздух или уље). Ово омогућава коришћење било ког објектива високе резолуције на тржишту. Такође не пати од спорог загревања због топлотне инерције (постиже тренутно загревање на скали од милисекунди) и користи само комерцијално доступне компоненте. Једина нова забринутост за безбедност односи се на присуство снажних ласерских зрака (обично до 100 мВ) унутар уређаја и можда кроз очи, за које су потребне заштитне наочаре.
Принцип ЛА-ХТМ је да користи ласер за локално загревање узорка у видном пољу микроскопа (слика 1а). Да бисте то урадили, узорак мора бити апсорбујући светлост. Да бисмо користили разумну снагу ласера (мање од 100 мВ), нисмо се ослањали на апсорпцију светлости течним медијумом, већ смо вештачки повећали апсорпцију узорка премазивањем супстрата наночестицама злата (слика 1ц). Загревање наночестица злата светлошћу је од фундаменталног значаја за област термалне плазмонике, са очекиваном применом у биомедицини, нанохемији или сакупљању сунчеве светлости29,30,31. Током протеклих неколико година, користили смо овај ЛА-ХТМ у неколико студија везаних за примену термалне плазме у физици, хемији и биологији. Главна потешкоћа са овом методом је у приказивању коначног температурног профила, пошто је повишена температура ограничена на регион микроскала унутар узорка. Показали смо да се температурно мапирање може постићи помоћу интерферометра попречног смицања са четири таласне дужине, једноставног, високе резолуције и веома осетљиве методе квантитативне фазне микроскопије засноване на употреби дводимензионалних дифракционих решетки (познатих и као унакрсне решетке) 33,34,35,36. Поузданост ове технике термичке микроскопије, засноване на микроскопији таласног фронта са укрштеним решеткама (ЦГМ), демонстрирана је у десетак радова објављених у протеклој деценији37,38,39,40,41,42,43.
Шема уградње паралелног ласерског микроскопа за грејање, обликовање и температуру. б Геометрија узорка која се састоји од АттофлуорТМ коморе која садржи покровно стакло обложено златним наночестицама. ц Пажљиво погледајте узорак (не у размери). д представља униформни профил ласерског зрака и (е) симулирану накнадну расподелу температуре на равни узорка наночестица злата. ф је прстенасти профил ласерског зрака погодан за генерисање униформне температуре као што је приказано у симулацији резултујуће расподеле температуре приказане у (г). Скала бар: 30 µм.
Конкретно, недавно смо постигли загревање ћелија сисара са ЛА-ХТМ и ЦГМ и пратили реакције ћелијског топлотног шока у опсегу од 37-42°Ц, демонстрирајући применљивост ове технике на снимање појединачних живих ћелија. Међутим, примена ЛА-ХТМ за проучавање микроорганизама на високим температурама није једнозначна, јер захтева већи опрез у поређењу са ћелијама сисара: прво, загревање дна медијума за десетине степени (а не за неколико степени) доводи до до јаког вертикалног градијента температуре. може створити конвекцију флуида 44 која, ако није чврсто причвршћена за подлогу, може изазвати нежељено кретање и мешање бактерија. Ова конвекција се може елиминисати смањењем дебљине слоја течности. У ту сврху, у свим експериментима представљеним у наставку, суспензије бактерија су стављене између два покровна стакла дебљине приближно 15 µм смештена у металну чашу (АттофлуорТМ, Тхермофисхер, сл. 1б,ц). У принципу, конвекција се може избећи ако је дебљина течности мања од величине зрака грејног ласера. Друго, рад у тако ограниченој геометрији може угушити аеробне организме (види слику С2). Овај проблем се може избећи коришћењем подлоге која је пропусна за кисеоник (или било који други витални гас), остављањем заробљених ваздушних мехурића унутар покровног стакла или бушењем рупа у горњем покровном стаклу (види слику С1) 45 . У овој студији изабрали смо последње решење (слике 1б и С1). Коначно, ласерско загревање не обезбеђује равномерну дистрибуцију температуре. Чак и при истом интензитету ласерског зрака (слика 1д), расподела температуре није равномерна, већ подсећа на Гаусову расподелу услед термичке дифузије (слика 1е). Када је циљ да се успоставе прецизне температуре у видном пољу за проучавање биолошких система, неравни профили нису идеални и такође могу довести до термофоретског кретања бактерија ако се не приањају за супстрат (видети сл. С3, С4)39. У ту сврху користили смо просторни модулатор светлости (СЛМ) да обликујемо инфрацрвени ласерски зрак у складу са обликом прстена (слика 1ф) у равни узорка како бисмо постигли савршено уједначену расподелу температуре унутар дате геометријске области, упркос топлотној дифузији (слика 1д) 39 , 42, 46. Поставите горњи поклопац преко металне посуде (слика 1б) да бисте избегли испаравање медијума и посматрајте најмање неколико дана. Пошто овај горњи поклопац није запечаћен, додатни медијум се може лако додати у било ком тренутку ако је потребно.
Да бисмо илустровали како ЛА-ХТМ функционише и демонстрирали његову применљивост у термофилним истраживањима, проучавали смо аеробне бактерије Геобациллус стеаротхермопхилус, које имају оптималну температуру раста од око 60-65°Ц. Бактерија такође има флагеле и способност пливања, што је још један показатељ нормалне ћелијске активности.
Узорци (слика 1б) су претходно инкубирани на 60°Ц један сат, а затим стављени у ЛА-ХТМ држач за узорке. Ова прединкубација је опциона, али ипак корисна, из два разлога: Прво, када се ласер укључи, узрокује да ћелије одмах расту и поделе (погледајте филм М1 у Додатним материјалима). Без претходне инкубације, раст бактерија се обично одлаже за око 40 минута сваки пут када се нова област за гледање загреје на узорку. Друго, прединкубација од 1 сата је подстакла адхезију бактерија на покривни стакал, спречавајући ћелије да изађу из видног поља због термофорезе када је ласер био укључен (погледајте филм М2 у Додатним материјалима). Термофореза је кретање честица или молекула дуж температурног градијента, обично од топлог до хладног, а бактерије нису изузетак43,47. Овај нежељени ефекат се елиминише на датој површини коришћењем СЛМ за обликовање ласерског зрака и постизање равне расподеле температуре.
На сл. На слици 2 приказана је дистрибуција температуре мерена ЦГМ добијеном зрачењем стаклене подлоге обложене наночестицама злата прстенастим ласерским снопом (слика 1ф). Уочена је равна расподела температуре по целој површини покривеној ласерским снопом. Ова зона је подешена на 65°Ц, оптималну температуру раста. Изван овог региона, температурна крива природно пада на \(1/р\) (где је \(р\) радијална координата).
Температурна мапа ЦГМ мерења добијена коришћењем прстенастог ласерског зрака за озрачивање слоја златних наночестица да би се добио раван температурни профил преко кружне површине. б Изотерма температурне карте (а). Контура ласерског зрака је представљена сивим тачкастим кругом. Експеримент је поновљен два пута (погледајте додатне материјале, слика С4).
Вијабилност бактеријских ћелија је праћена неколико сати коришћењем ЛА-ХТМ. На сл. 3 приказује временски интервал за четири слике снимљене из филма од 3 сата и 20 минута (Филм М3, Додатне информације). Примећено је да се бактерије активно размножавају унутар кружног подручја дефинисаног ласером где је температура била оптимална, приближавајући се 65°Ц. Насупрот томе, раст ћелија је значајно смањен када је температура пала испод 50 ° Ц током 10 с.
Слике оптичке дубине бактерија Г. стеаротхермопхилус које расту након загревања ласером у различито време, (а) т = 0 мин, (б) 1 х 10 мин, (ц) 2 х 20 мин, (д) 3 х 20 мин, од 200 Извучено из једноминутног филма (М3 филм је дат у Додатним информацијама) који је постављен на одговарајућу температурну мапу. Ласер се укључује у време \(т=0\). Изотерме су додате слици интензитета.
Да бисмо даље квантификовали раст ћелија и његову зависност од температуре, измерили смо повећање биомасе различитих колонија првобитно изолованих бактерија у видном пољу Мовие М3 (слика 4). Родитељске бактерије одабране на почетку формирања јединице за формирање мини колонија (мЦФУ) приказане су на слици С6. Мерења суве масе вршена су камером ЦГМ 48 која је коришћена за мапирање дистрибуције температуре. Способност ЦГМ-а да мери суву тежину и температуру је снага ЛА-ХТМ-а. Као што се и очекивало, висока температура је изазвала бржи раст бактерија (слика 4а). Као што је приказано на полу-лог дијаграму на слици 4б, раст на свим температурама прати експоненцијални раст, где подаци користе експоненцијалну функцију \(м={м}_{0}{10}^{т/\ тау }+ {{ \мбок{цст}}}\), где је \(\тау {{{{{\рм{лог }}}}}}}2\) – време генерисања (или време удвостручавања), \( г =1/ \тау\) – стопа раста (број подела по јединици времена). На сл. 4ц приказује одговарајућу брзину раста и време генерисања као функцију температуре. Брзо растуће мЦФУ карактерише засићење раста након два сата, очекивано понашање због велике густине бактерија (слично стационарној фази у класичним течним културама). Општи облик \(г\лефт(Т\ригхт)\) (слика 4ц) одговара очекиваној двофазној кривој за Г. стеаротхермопхилус са оптималном стопом раста око 60-65°Ц. Успоредите податке помоћу кардиналног модела (Слика С5)49 где је \(\лефт({{Г}_{0}{;\;Т}}_{{\мин}};{Т}_{{опт} } ;{Т}_{{\мак}}\ригхт)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °Ц, што се добро слаже са другим вредностима наведеним у литератури49. Иако су параметри зависни од температуре поновљиви, максимална стопа раста \({Г}_{0}\) може да варира од једног експеримента до другог (погледајте слике С7-С9 и филм М4). За разлику од параметара прилагођавања температуре, који би требало да буду универзални, максимална брзина раста зависи од особина медијума (доступност хранљивих материја, концентрација кисеоника) унутар посматране геометрије микроскала.
а Раст микроба на различитим температурама. мЦФУ: минијатурне јединице за формирање колонија. Подаци добијени из видео снимка једне бактерије која расте у температурном градијенту (филм М3). б Исто као (а), полулогаритамска скала. ц Стопа раста\(\тау\) и време генерисања\(г\) израчунато из линеарне регресије (б). Хоризонталне траке грешке: температурни опсег преко којег су се мЦФУ прошириле у видно поље током раста. Траке вертикалне грешке: стандардна грешка линеарне регресије.
Поред нормалног раста, неке бактерије су понекад испливале на видјело током ласерског загревања, што је очекивано понашање за бактерије са флагелама. Филм М5 у додатним информацијама приказује такве пливачке активности. У овом експерименту, уједначено ласерско зрачење је коришћено за стварање температурног градијента, као што је приказано на сликама 1д, е и С3. Слика 5 приказује две секвенце слика изабране из филма М5 које показују да једна бактерија показује усмерено кретање док све остале бактерије остају непомичне.
Два временска оквира (а) и (б) показују пливање две различите бактерије означене тачкастим круговима. Слике су извучене из филма М5 (достављено као додатни материјал).
У случају Г. стеаротхермопхилус, активно кретање бактерија (слика 5) почело је неколико секунди након укључивања ласерског зрака. Ово запажање наглашава временски одговор овог термофилног микроорганизма на повећање температуре, као што су већ приметили Мора ет ал. 24 . Тема покретљивости бактерија, па чак и термотаксије, може се даље истражити коришћењем ЛА-ХТМ.
Микробно пливање не треба мешати са другим типовима физичког кретања, наиме (и) Брауново кретање, које изгледа као хаотично кретање без одређеног смера, (ии) конвекција 50 и термофореза 43, које се састоје од правилног кретања дуж температуре градијент.
Г. стеаротхермопхилус је познат по својој способности да производи веома отпорне споре (формирање спора) када је изложен неповољним условима околине као одбрану. Када услови животне средине поново постану повољни, споре клијају, формирајући живе ћелије и настављају раст. Иако је овај процес спорулације/клијања добро познат, никада није примећен у реалном времену. Користећи ЛА-ХТМ, овде извештавамо о првом запажању догађаја клијања код Г. стеаротхермопхилус.
На сл. 6а приказује временске слике оптичке дубине (ОТ) добијене коришћењем ЦГМ сета од 13 спора. За све време сакупљања (15 х 6 мин, \(т=0\) – почетак ласерског загревања), клијало је 4 од 13 спора, у узастопним временским тачкама \(т=2\) х, \( 3\ ) х \(10 \)', \(9\) х \(40\)' и \(11\) х \(30\)'. Иако је само један од ових догађаја приказан на слици 6, 4 догађаја клијања могу се приметити у М6 филму у додатном материјалу. Занимљиво је да је клијање насумично: не клијају све споре и не клијају у исто време, упркос истим променама у условима животне средине.
а Тиме-лапсе који се састоји од 8 ОТ слика (урањање у уље, 60к, 1,25 НА објектив) и (б) еволуција биомасе агрегата Г. стеаротхермопхилус. ц (б) Нацртано на полу-лог скали да би се истакла линеарност стопе раста (испрекидана линија).
На сл. 6б,ц приказује биомасу ћелијских популација у видном пољу као функцију времена током читавог периода прикупљања података. Брзо распадање суве масе примећено на \(т=5\)х на сл. 6б, ц, због изласка неких ћелија из видног поља. Стопа раста ова четири догађаја је \(0,77\пм 0,1\) х-1. Ова вредност је виша од стопе раста која је повезана са сликама 3. 3 и 4, где ћелије расту нормално. Разлог за повећану стопу раста Г. стеаротхермопхилус из спора је нејасан, али ова мерења наглашавају интересовање ЛА-ХТМ-а и раде на нивоу једне ћелије (или на нивоу једне мЦФУ) како би сазнали више о динамици живота ћелије .
Да бисмо даље демонстрирали свестраност ЛА-ХТМ-а и његове перформансе на високим температурама, испитали смо раст Сулфолобус схибатае, хипертермофилне ацидофилне археје са оптималном температуром раста од 80°Ц51. У поређењу са Г. стеаротхермопхилус, ове археје такође имају веома различиту морфологију, више личе на куглице од 1 микрона (коке) него на издужене шипке (бациле).
Слика 7а се састоји од секвенцијалних оптичких слика дубине С. схибатае мЦФУ добијених коришћењем ЦГМ (погледајте М7 играни филм у Додатним материјалима). Овај мЦФУ расте на око 73°Ц, испод оптималне температуре од 80°Ц, али унутар температурног опсега за активан раст. Приметили смо вишеструке догађаје фисије који су учинили да мЦФУ изгледају као микрогрожђе археја након неколико сати. Из ових ОТ слика, биомаса мЦФУ је мерена током времена и представљена на слици 7б. Занимљиво је да су мЦФУ С. схибатае показивале линеарни раст, а не експоненцијални раст уочен код мЦФУ Г. стеаротхермопхилус. Постојала је дугогодишња дискусија 52 о природи стопа раста ћелија: док неке студије извештавају о стопама раста микроба које су пропорционалне њиховој величини (експоненцијални раст), друге показују константну стопу (линеарни или билинеарни раст). Као што су објаснили Тзур ет ал.53, разликовање између експоненцијалног и (би)линеарног раста захтева прецизност од <6% у мерењима биомасе, што је ван домашаја за већину КПМ техника, чак и укључујући интерферометрију. Као што су објаснили Тзур ет ал.53, разликовање између експоненцијалног и (би)линеарног раста захтева прецизност од <6% у мерењима биомасе, што је ван домашаја за већину КПМ техника, чак и укључујући интерферометрију. Како објаснили Цур и др.53, различить експоненциальное и (би)линејное роста требует точность <6% в измерениах биомаси, что недостижимо за большинство методов КПМ, даже с использованием интерферометрии. Као што су објаснили Зур ет ал.53, разликовање експоненцијалног и (би)линеарног раста захтева <6% тачности у мерењима биомасе, што је недостижно за већину КПМ метода, чак и коришћењем интерферометрије.Како су објаснили Зур ет ал. 53, разликовање експоненцијалног и (би)линеарног раста захтева мање од 6% тачности у мерењу биомасе, што је недостижно за већину КПМ метода, чак и када се користи интерферометрија. ЦГМ постиже ову тачност са тачношћу испод пг у мерењу биомасе36,48.
а Тиме-лапсе који се састоји од 6 ОТ слика (урањање у уље, 60к, НА циљ 1.25) и (б) еволуција микро-ЦФУ биомасе мерена са ЦГМ. Погледајте филм М7 за више информација.
Савршено линеаран раст С. схибатае био је неочекиван и још увек није пријављен. Међутим, очекује се експоненцијални раст, барем зато што се током времена морају десити вишеструке поделе од 2, 4, 8, 16 ... ћелија. Претпоставили смо да би линеарни раст могао бити последица инхибиције ћелија услед густог паковања ћелија, баш као што се раст ћелија успорава и на крају достиже стање мировања када је густина ћелија превисока.
Закључујемо разматрањем следећих пет интересантних тачака редом: смањење запремине грејања, смањење топлотне инерције, интересовање за наночестице злата, интересовање за квантитативну фазну микроскопију и могући температурни опсег у којем се ЛА-ХТМ може користити.
У поређењу са отпорним грејањем, ласерско грејање које се користи за развој ХТМ нуди неколико предности, које илуструјемо у овој студији. Конкретно, у течним медијима у видном пољу микроскопа, запремина грејања се одржава унутар неколико (10 μм) 3 запремине. На овај начин су активни само посматрани микроби, док су друге бактерије у стању мировања и могу се користити за даље проучавање узорка – нема потребе да се узорак мења сваки пут када треба да се провери нова температура. Поред тога, микрозагревање омогућава директно испитивање великог распона температура: Слика 4ц је добијена из 3-сатног филма (Мовие М3), који обично захтева припрему и испитивање неколико узорака – по један за сваки од испитиваних узорака. и је температура која представља број дана у експерименту. Смањење загрејане запремине такође одржава све околне оптичке компоненте микроскопа, посебно сочиво објектива, на собној температури, што је до сада био велики проблем са којим се заједница суочавала. ЛА-ХТМ се може користити са било којим сочивом, укључујући сочива за урањање у уље, и остаће на собној температури чак и при екстремним температурама у видном пољу. Главно ограничење методе ласерског загревања које извештавамо у овој студији је да ћелије које се не лепе или плутају могу бити далеко од видног поља и тешке за проучавање. Заобилазно решење би могло бити коришћење сочива са малим увећањем да би се постигао већи пораст температуре од неколико стотина микрона. Овај опрез је праћен смањењем просторне резолуције, али ако је циљ проучавање кретања микроорганизама, висока просторна резолуција није потребна.
Временска скала за загревање (и хлађење) система \({{{{{\рм{\тау }}}}}}}_{{{\мбок{Д}}}}) зависи од његове величине, према закону \({{{({\рм{\тау }}}}}}_{{{\мбок{Д}}}={Л}^{2}/Д\), где је \ (Л\ ) је карактеристична величина извора топлоте (пречник ласерског зрака у нашој студији је \(Л\ око 100\) μм), \(Д\) је топлотна дифузивност околине (просек у нашој случај, стакло и вода Брзина дифузије\(Д\ око 2\пута {10}^{-7}\) м2/с Према томе, у овој студији, временски одговори реда 50 мс, тј. квази-тренутни). температурне промене, може се очекивати Ово тренутно успостављање пораста температуре не само да скраћује трајање експеримента, већ такође омогућава прецизно време \(т=0\) за било које динамичко проучавање температурних ефеката.
Наш предложени метод је применљив на било коју подлогу која упија светлост (на пример, комерцијални узорци са ИТО премазом). Међутим, наночестице злата су у стању да обезбеде високу апсорпцију у инфрацрвеном и ниску апсорпцију у видљивом опсегу, чије су последње карактеристике од интереса за ефикасно оптичко посматрање у видљивом опсегу, посебно када се користи флуоресценција. Поред тога, злато је биокомпатибилно, хемијски инертно, оптичка густина се може подесити од 530 нм до скоро инфрацрвене, а припрема узорка је једноставна и економична29.
Микроскопија таласног фронта са попречним решеткама (ЦГМ) омогућава не само мапирање температуре на микроскали, већ и праћење биомасе, што је чини посебно корисним (ако није неопходно) у комбинацији са ЛА-ХТМ. Током протекле деценије развијене су и друге технике температурне микроскопије, посебно у области биоимагинга, а већина њих захтева употребу флуоресцентних сонди осетљивих на температуру54,55. Међутим, ове методе су критиковане и неки извештаји су мерили нереалне промене температуре унутар ћелија, вероватно због чињенице да флуоресценција зависи од многих фактора осим температуре. Поред тога, већина флуоресцентних сонди је нестабилна на високим температурама. Стога, КПМ и посебно ЦГМ представљају идеалну температурну микроскопску технику за проучавање живота на високим температурама помоћу оптичке микроскопије.
Студије С. схибатае, које живе оптимално на 80°Ц, показују да се ЛА-ХТМ може применити за проучавање хипертермофила, а не само једноставних термофила. У принципу, не постоји ограничење распона температура које се могу постићи коришћењем ЛА-ХТМ, па чак и температуре изнад 100°Ц могу се постићи на атмосферском притиску без кључања, као што је показала наша група од 38 у хидротермалним хемијским применама на атмосферском притисак А. Ласер се користи за загревање наночестица злата 40 на исти начин. Дакле, ЛА-ХТМ има потенцијал да се користи за посматрање хипертермофила без преседана са стандардном оптичком микроскопом високе резолуције у стандардним условима (тј. под стресом околине).
Сви експерименти су изведени коришћењем микроскопа домаће израде, укључујући Келерово осветљење (са ЛЕД, М625Л3, Тхорлабс, 700 мВ), држач узорка са ручним ки померањем, објективе (Олимпус, 60к, 0,7 НА, аир, ЛУЦПланФЛН60Кс или 60к, НА О О). , УПЛФЛН60КСОИ), ЦГМ камера (КЛСИ унакрсна решетка, 39 µм корак, 0,87 мм од Андор Зила сензора камере) за пружање слике интензитета и таласног фронта, и сЦМОС камера (ОРЦА Фласх 4.0 В3, 16-битни режим, из Хамаматсуа) за снимање подаци приказани на слици 5 (бактеријско пливање). Дихроични разделник снопа је ивица БригхтЛине од 749 нм (Семроцк, ФФ749-СДи01). Филтер на предњој страни камере је 694 краткопропусни филтер (ФФ02-694/СП-25, Семроцк). Титан сафирни ласер (Ласер Верди Г10, 532 нм, 10 В, пумпана цунами ласерска шупљина, Спецтра-Пхисицс на слици 2-5, даље замењен Миллениа ласером, Спецтрапхисицс 10 В, пумпана Мира ласерска шупљина, Кохерентна, за Сл. -5). 6 и 7) су подешене на таласну дужину \({{{({\рм{\ламбда }}}}}}=800\) нм, што одговара плазмонском резонантном спектру наночестица злата. Просторни модулатори светлости (1920 × 1152 пиксела) купљени су од Меадовларк Оптицс-а.
Микроскопија таласног фронта са унакрсном решетком (ЦГМ) је техника оптичке микроскопије заснована на комбиновању дводимензионалне дифракционе решетке (познате и као унакрсна решетка) на удаљености од једног милиметра од сензора конвенционалне камере. Најчешћи пример ЦГМ-а који смо користили у овој студији назива се интерферометар са попречним помаком са четири таласне дужине (КЛСИ), где се унакрсна решетка састоји од обрасца шаховнице интензитета/фазе који су увели и патентирали Примот ет ал. у 200034. Вертикалне и хоризонталне линије решетке стварају сенке у облику мреже на сензору, чије се изобличење може нумерички обрадити у реалном времену да би се добило оптичко изобличење таласног фронта (или еквивалентан фазни профил) упадне светлости. Када се користи на микроскопу, ЦГМ камера може да прикаже разлику оптичке путање снимљеног објекта, такође познату као оптичка дубина (ОТ), са осетљивошћу реда нанометара36. У било ком ЦГМ мерењу, да би се елиминисали било какви дефекти у оптичким компонентама или сноповима, примарни референтни ОТ снимак се мора узети и одузети од свих наредних слика.
Температурна микроскопија је изведена коришћењем ЦГМ камере као што је описано у референци. 32. Укратко, загревање течности мења њен индекс преламања, стварајући ефекат термичког сочива који искривљује упадни сноп. Ову дисторзију таласног фронта мери ЦГМ и обрађује помоћу алгоритма деконволуције да би се добила тродимензионална расподела температуре у течном медијуму. Ако су наночестице злата равномерно распоређене по узорку, мапирање температуре може да се уради у областима без бактерија да би се добиле боље слике, што је оно што понекад радимо. Референтна ЦГМ слика је добијена без грејања (са искљученим ласером) и накнадно снимљена на истој локацији на слици са укљученим ласером.
Мерење суве масе се постиже коришћењем исте ЦГМ камере која се користи за снимање температуре. ЦГМ референтне слике су добијене брзим померањем узорка у к и и током експозиције као средство за усредњавање било које нехомогености у ОТ-у због присуства бактерија. Од ОТ слика бактерија, њихова биомаса је добијена коришћењем ансамбла слика преко области одабраних коришћењем Матлаб-овог домаћег алгоритма сегментације (погледајте пододељак „Нумерички код“), пратећи процедуру описану у реф. 48. Укратко, користимо релацију \(м={\алпха}^{-1}\иинт {{\мбок{ОТ}}}\лефт(к,и\ригхт){{\мбок{д}} } к{{\мбок{д}}}и\), где је \({{\мбок{ОТ}}}\лефт(к,и\ригхт)\) слика оптичке дубине, \(м\) је сува тежина и \({{{{{\рм{\алпха }}}}}}\) је константа. Изабрали смо \({{{{\рм{\алпха))))))=0,18\) µм3/пг, што је типична константа за живе ћелије.
Поклопац пречника 25 мм и дебљине 150 µм обложен златним наночестицама стављен је у АттофлуорТМ комору (Тхермофисхер) са златним наночестицама окренутим нагоре. Геобациллус стеаротхермопхилус је претходно култивисан преко ноћи у ЛБ медијуму (200 рпм, 60°Ц) пре сваког дана експеримената. Кап од 5 µл суспензије Г. стеаротхермопхилус са оптичком густином (ОД) од 0,3 до 0,5 стављена је на покривно стакло са златним наночестицама. Затим је на кап испуштена округла покривна плочица пречника 18 мм са рупом пречника 5 мм у центру, а на центар рупе је више пута наношено 5 μл бактеријске суспензије исте оптичке густине. Бунари на покровним стакалцима припремљени су у складу са поступком описаним у реф. 45 (погледајте Додатне информације за више информација). Затим додајте 1 мл ЛБ медијума у покровно стакло како бисте спречили да се течни слој осуши. Последњи поклопац се ставља преко затвореног поклопца Аттофлуор™ коморе како би се спречило испаравање медијума током инкубације. За експерименте клијања користили смо споре, које су, после конвенционалних експеримената, понекад прекривале горњи поклопац. Сличан метод је коришћен за добијање Сулфолобус схибатае. Три дана (200 рпм, 75°Ц) прелиминарне култивације Тхиобациллус серрата обављена су у медијуму 182 (ДСМЗ).
Узорци наночестица злата су припремљени мицеларном блок кополимерском литографијом. Овај процес је детаљно описан у погл. 60. Укратко, мицеле које инкапсулирају јоне злата су синтетизоване мешањем кополимера са ХАуЦл4 у толуену. Очишћени покровни стакалци су затим потопљени у раствор и третирани УВ зрачењем у присуству редукционог средства да би се добило златно семе. Коначно, семе злата је узгајано контактом покровног стакла са воденим раствором КАуЦл4 и етаноламина током 16 минута, што је резултирало квазипериодичним и веома уједначеним распоредом несферичних наночестица злата у блиском инфрацрвеном спектру.
Да бисмо интерферограме претворили у ОТ слике, користили смо домаћи алгоритам, као што је детаљно описано на линку. 33 и доступан је као Матлаб пакет у следећем јавном спремишту: хттпс://гитхуб.цом/баффоу/ЦГМпроцесс. Пакет може израчунати интензитет и ОТ слике на основу снимљених интерферограма (укључујући референтне слике) и удаљености низа камера.
Да бисмо израчунали фазни образац примењен на СЛМ да бисмо добили дати профил температуре, користили смо претходно развијени домаћи алгоритам39,42 који је доступан у следећем јавном спремишту: хттпс://гитхуб.цом/баффоу/СЛМ_температуреСхапинг. Улаз је поље жељене температуре, које се може подесити дигитално или преко монохроматског бмп слике.
Да бисмо сегментирали ћелије и измерили њихову суву тежину, користили смо наш Матлаб алгоритам објављен у следећем јавном спремишту: хттпс://гитхуб.цом/баффоу/ЦГМ_магицВандСегментатион. На свакој слици, корисник мора да кликне на бактерију или мЦФУ од интереса, подеси осетљивост штапића и потврди избор.
За више информација о дизајну студије, погледајте сажетак Извештаја о истраживању природе повезан са овим чланком.
Подаци који подржавају резултате ове студије доступни су од одговарајућих аутора на разуман захтев.
Изворни код који се користи у овој студији је детаљно описан у одељку Методе, а верзије за отклањање грешака могу се преузети са хттпс://гитхуб.цом/баффоу/ у следећим репозиторијумима: СЛМ_температуреСхапинг, ЦГМпроцесс и ЦГМ_магицВандСегментатион.
Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. & Схарма, АК Увид у термофиле и њихове примене широког спектра. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. & Схарма, АК Увид у термофиле и њихове примене широког спектра.Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. и Схарма, АК Преглед термофила и њихова широка примена. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. и Схарма, АК 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамле, Д. и Схарма, АК.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Схарма АК Дубоко разумевање термофила и широк спектар примена.3 Биотехнологија 6, 81 (2016).
Време поста: 26.09.2022