Алцхајмеровој болести (АД) недостају протеински биомаркери који одражавају њену вишеструку основну патофизиологију, ометајући напредак дијагнозе и лечења. Овде користимо свеобухватну протеомику да идентификујемо биомаркере цереброспиналне течности (ЦСФ) који представљају широк спектар патофизиологије АД. Мултиплекс масена спектрометрија је идентификовала приближно 3.500 и приближно 12.000 протеина у АД ЦСФ и мозгу, респективно. Мрежна анализа протеома мозга разрешила је 44 модула биодиверзитета, од којих се 15 преклапало са протеомом цереброспиналне течности. Маркери ЦСФ АД у овим модулима који се преклапају су пресавијени у пет група протеина, што представља различите патофизиолошке процесе. Синапсе и метаболити у АД мозгу се смањују, али се ЦСФ повећава, док се мијелинизација богата глијама и имуне групе у мозгу и ЦСФ повећавају. Конзистентност и специфичност болести код промена панела потврђене су у више од 500 додатних узорака ЦСФ. Ове групе су такође идентификовале биолошке подгрупе у асимптоматској АД. Све у свему, ови резултати су обећавајући корак ка веб-базираним алатима за биомаркере за клиничке примене у АД.
Алцхајмерова болест (АД) је најчешћи узрок неуродегенеративне деменције широм света и карактерише је широк спектар дисфункција биолошког система, укључујући синаптички пренос, имунитет посредован глијама и метаболизам митохондрија (1-3). Међутим, његови утврђени протеински биомаркери се и даље фокусирају на откривање амилоида и тау протеина, и стога не могу одражавати ову разнолику патофизиологију. Ови „језгро“ протеинских биомаркера који се најпоузданије мере у цереброспиналној течности (ЦСФ) укључују (и) амилоид бета пептид 1-42 (Аβ1-42), који одражава формирање кортикалних амилоидних плакова; (ии) тотални тау, знак дегенерације аксона; (иии) фосфо-тау (п-тау), представник патолошке хиперфосфорилације тау (4-7). Иако су ови биомаркери цереброспиналне течности у великој мери олакшали наше откривање „означених“ болести протеина АД (4-7), они представљају само мали део комплексне биологије иза ове болести.
Недостатак патофизиолошке разноликости АД биомаркера довео је до многих изазова, укључујући (и) немогућност да се идентификује и квантификује биолошка хетерогеност пацијената са АД, (ии) недовољно мерење тежине и прогресије болести, посебно у претклиничкој фази, и ( иии) развој терапеутских лекова који нису успели да у потпуности реше све аспекте неуролошког погоршања. Наше ослањање на значајну патологију да опишемо АД од сродних болести само погоршава ове проблеме. Све више доказа показује да већина старијих особа са деменцијом има више од једне патолошке карактеристике когнитивног пада (8). Чак 90% или више особа са АД патологијом такође има васкуларне болести, инклузије ТДП-43 или друге дегенеративне болести (9). Ове високе пропорције патолошког преклапања су пореметиле наш тренутни дијагностички оквир за деменцију и потребна је свеобухватнија патофизиолошка дефиниција болести.
С обзиром на хитну потребу за разним АД биомаркерима, ова област све више усваја методу „омике“ засновану на целокупном систему за откривање биомаркера. Алијанса Аццелератед Пхармацеутицал Партнерсхип (АМП)-АД покренута је 2014. године и на челу је програма. Овај мултидисциплинарни напор Националног института за здравље, академске заједнице и индустрије има за циљ да користи системске стратегије за боље дефинисање патофизиологије АД и развој дијагностичке анализе биодиверзитета и стратегија лечења (10). Као део овог пројекта, мрежна протеомика је постала обећавајуће средство за унапређење системских биомаркера у АД. Овај непристрасни приступ заснован на подацима организује сложене скупове података о протеомици у групе или „модуле“ ко-експресираних протеина који су повезани са специфичним типовима ћелија, органелама и биолошким функцијама (11-13). Скоро 12 студија о мрежној протеомици богатих информацијама спроведено је на АД мозгу (13-23). Све у свему, ове анализе показују да протеом АД мождане мреже одржава високо очувану модуларну организацију у независним кохортама и вишеструким кортикалним регионима. Поред тога, неки од ових модула показују поновљиве промене у обиљу повезаних са АД у низовима података, одражавајући патофизиологију више болести. Заједно, ови налази показују обећавајућу сидришну тачку за откриће протеома мождане мреже као системског биомаркера у АД.
Да бисмо трансформисали протеом АД мождане мреже у клинички корисне биомаркере засноване на систему, комбиновали смо мрежу изведену из мозга са протеомском анализом АД ЦСФ. Овај интегрисани приступ довео је до идентификације пет обећавајућих скупова биомаркера ЦСФ који су повезани са широким спектром патофизиологије засноване на мозгу, укључујући синапсе, крвне судове, мијелинизацију, упалу и дисфункцију метаболичких путева. Успешно смо потврдили ове панеле биомаркера кроз вишеструке анализе репликације, укључујући више од 500 ЦСФ узорака из различитих неуродегенеративних болести. Ове валидационе анализе укључују испитивање групних циљева у ЦСФ пацијената са асимптоматском АД (АсимАД) или показивање доказа о абнормалној акумулацији амилоида у нормалном когнитивном окружењу. Ове анализе наглашавају значајну биолошку хетерогеност у АсимАД популацији и идентификују панел маркере који могу бити у стању да подтипују појединце у најранијим стадијумима болести. Све у свему, ови резултати представљају кључни корак у развоју алата за протеинске биомаркере засноване на више система који могу успешно да реше многе клиничке изазове са којима се суочава АД.
Главна сврха ове студије је да се идентификују нови биомаркери цереброспиналне течности који одражавају различите патофизиологије засноване на мозгу које доводе до АД. Слика С1 приказује нашу методологију истраживања, која укључује (и) свеобухватну анализу вођену прелиминарним налазима АД ЦСФ и мрежног протеома мозга ради идентификације више биомаркера болести ЦСФ повезаних са мозгом, и (ии) накнадну репликацију Ови биомаркери се налазе у неколико независних цереброспиналних течне кохорте. Истраживање оријентисано на откриће почело је анализом диференцијалне експресије ЦСФ код 20 когнитивно нормалних појединаца и 20 пацијената са АД у Центру за истраживање Алцхајмерове болести Емори Гоизуета (АДРЦ). Дијагноза АД се дефинише као значајно когнитивно оштећење у присуству ниског Аβ1-42 и повишених нивоа укупног тау и п-тау у цереброспиналној течности [Меан Монтреал Цогнитиве Ассессмент (МоЦА), 13,8 ± 7,0] [ЕЛИСА (ЕЛИСА )]] (Табела С1А). Контрола (средња вредност МоЦА, 26,7 ± 2,2) имала је нормалне нивое биомаркера ЦСФ.
Људску ликвору карактерише динамички опсег обиља протеина, у којем албумин и други изузетно богати протеини могу спречити откривање протеина од интереса (24). Да бисмо повећали дубину открића протеина, уклонили смо првих 14 протеина са великом изобиљем из сваког узорка ЦСФ пре анализе масене спектрометрије (МС) (24). МС је идентификовао укупно 39.805 пептида, који су мапирани на 3691 протеом у 40 узорака. Квантификација протеина се врши обележавањем вишеструке тандем масе (ТМТ) (18, 25). Да бисмо решили недостајуће податке, укључили смо само оне протеине који су квантификовани у најмање 50% узорака у следећој анализи, чиме смо коначно квантификовали 2875 протеома. Због значајне разлике у нивоима укупне количине протеина, контролни узорак је статистички сматран изванредним (13) и није укључен у каснију анализу. Вредности распрострањености преосталих 39 узорака су прилагођене према старости, полу и коваријанси серије (13-15, 17, 18, 20, 26).
Користећи статистичку анализу т-теста за процену диференцијалне експресије на скупу података регресије, ова анализа је идентификовала протеине чији су нивои заступљености значајно промењени (П <0,05) између контролног и АД случајева (Табела С2А). Као што је приказано на слици 1А, бројност од укупно 225 протеина у АД је значајно смањена, а бројност 303 протеина је значајно повећана. Ови различито експримирани протеини укључују неколико претходно идентификованих АД маркера цереброспиналне течности, као што је протеин тау повезан са микротубулама (МАПТ; П = 3,52 × 10−8), неурофиламент (НЕФЛ; П = 6,56 × 10−3), протеин повезан са растом 43 (ГАП43; П = 1,46 × 10−5), протеин који везује масну киселину 3 (ФАБП3; П = 2,00 × 10−5), хитиназа 3 као 1 (ЦХИ3Л1; П = 4,44 × 10−6), Неурални гранулин (НРГН; П = 3,43 × 10−4) и фактор раста нерава ВГФ (ВГФ; П = 4,83 × 10−3) (4-6). Међутим, идентификовали смо и друге веома важне циљеве, као што су инхибитор ГДП дисоцијације 1 (ГДИ1; П = 1,54 × 10-10) и модуларно везивање калцијума везано за СПАРЦ 1 (СМОЦ1; П = 6,93 × 10-9). Анализа генске онтологије (ГО) 225 значајно редукованих протеина открила је блиске везе са процесима телесних течности као што су метаболизам стероида, коагулација крви и активност хормона (Слика 1Б и Табела С2Б). Насупрот томе, значајно повећан протеин 303 је уско повезан са ћелијском структуром и енергетским метаболизмом.
(А) Графикон вулкана показује промену лог2 пута (к-оса) у односу на -лог10 статистичку П вредност (и-оса) добијену т-тестом, који се користи за откривање диференцијалне експресије између контролне (ЦТ) и АД случајеви протеома ЦСФ Од свих протеина. Протеини са значајно смањеним нивоима (П <0,05) у АД приказани су плавом бојом, док су протеини са значајно повишеним нивоима у болести приказани црвеном бојом. Изабрани протеин је означен. (Б) Главни ГО термини који се односе на протеин су значајно смањени (плави) и повећани (црвени) у АД. Приказује три ГО термина са највишим з-скорима у областима биолошких процеса, молекуларних функција и ћелијских компоненти. (Ц) МС је измерио ниво МАПТ у узорку ЦСФ (лево) и његову корелацију са ЕЛИСА нивоом тау узорка (десно). Приказује се Пирсонов коефицијент корелације са релевантном П вредношћу. Због недостатка ЕЛИСА података за један случај АД, ове бројке укључују вредности за 38 од 39 анализираних случајева. (Д) Надзирана кластер анализа (П <0,0001, Бењамини-Хохберг (БХ) прилагођен П <0,01) на контролној и АД ЦСФ пронађеним узорцима користећи 65 најзначајније измењених протеина у скупу података. Стандардизовати, нормализовати.
Протеомски ниво МАПТ је уско повезан са независно измереним ЕЛИСА нивоом тау (р = 0,78, П = 7,8 × 10-9; Слика 1Ц), што подржава валидност нашег МС мерења. Након дигестије трипсина на нивоу амилоидног прекурсора протеина (АПП), пептиди специфични за изоформу мапирани на Ц-терминус Аβ1-40 и Аβ1-42 не могу се ефикасно јонизовати (27, 28). Стога, АПП пептиди које смо идентификовали немају никакве везе са нивоима ЕЛИСА Аβ1-42. Да бисмо проценили диференцијалну експресију у сваком случају, користили смо диференцијално експримиране протеине са П <0,0001 [стопа лажног откривања (ФДР) коригована П <0,01] да бисмо извршили надгледану анализу кластера узорака (Табела С2А). Као што је приказано на слици 1Д, ових 65 високо значајних протеина може правилно групирати узорке према стању болести, осим једног случаја АД са карактеристикама сличним контроли. Од ових 65 протеина, 63 су порасла у АД, док су се само два (ЦД74 и ИСЛР) смањила. Укупно, ове анализе цереброспиналне течности су идентификовале стотине протеина у АД који могу послужити као биомаркери болести.
Затим смо извршили независну мрежну анализу АД можданог протеома. Кохорта мозга овог открића укључивала је дорсолатерални префронтални кортекс (ДЛПФЦ) из контролне (н = 10), Паркинсонову болест (ПД; н = 10), мешовити АД/ПД (н = 10) и АД (н = 10) случајева. ) Узорак. Емери Гоизуета АДРЦ. Демографија ових 40 случајева је претходно описана (25) и сажета је у табели С1Б. Користили смо ТМТ-МС да анализирамо ових 40 можданих ткива и кохорту репликације од 27 случајева. Укупно, ова два скупа података о мозгу произвела су 227.121 јединствени пептид, који су мапирани на 12.943 протеома (25). Само они протеини који су квантификовани у најмање 50% случајева укључени су у накнадна истраживања. Коначни скуп података о открићу садржи 8817 квантификованих протеина. Подесите нивое обиља протеина на основу старости, пола и постмортем интервала (ПМИ). Анализа диференцијалне експресије скупа података након регресије показала је да је >2000 нивоа протеина значајно промењено [П <0,05, анализа варијансе (АНОВА)] у две или више кохорти болести. Затим смо извршили надгледану кластер анализу засновану на диференцијално експримираним протеинима и П <0,0001 у АД/контролној и/или АД/ПД поређењима (Слика С2, А и Б, Табела С2Ц). Ових 165 високо измењених протеина јасно осликавају случајеве са АД патологијом из контролних и ПД узорака, потврђујући снажне промене специфичне за АД у целом протеому.
Затим смо користили алгоритам назван Веигхтед Гене Цо-екпрессион Нетворк Аналисис (ВГЦНА) да извршимо анализу мреже на откривеном протеому мозга, који организује скуп података у протеинске модуле са сличним обрасцима експресије (11-13). Анализа је идентификовала 44 модула (М) коекспресираних протеина, сортираних и нумерисаних од највећих (М1, н = 1821 протеина) до најмањих (М44, н = 34 протеина) (Слика 2А и Табела С2Д)). Као што је горе поменуто (13) Израчунајте репрезентативни профил експресије или карактеристични протеин сваког модула и повежите га са стањем болести и патологијом АД, односно успоставите савез регистра Алцхајмерове болести (ЦЕРАД) и Брааковог резултата (Слика 2Б). Укупно, 17 модула је било значајно повезано са неуропатологијом АД (П <0,05). Многи од ових модула повезаних са болестима такође су богати маркерима специфичним за тип ћелије (Слика 2Б). Као што је горе поменуто (13), обогаћивање типа ћелије се одређује анализом преклапања модула и референтне листе гена специфичних за тип ћелије. Ови гени су изведени из објављених података у изолованим мишјим неуронима, ендотелним и глијалним ћелијама. Експеримент секвенционирања РНК (РНА-сек) (29).
(А) Откријте ВГЦНА можданог протеома. (Б) Двотежинска средња корелација (БиЦор) анализа модуларног сигнатурног протеина (прва главна компонента модуларне експресије протеина) са неуропатолошким карактеристикама АД (горе), укључујући ЦЕРАД (Аβ плак) и Браак (тау танглес) резултате. Интензитет позитивне (црвене) и негативне (плаве) корелације приказан је двобојном топлотном мапом, а звездице означавају статистичку значајност (П <0,05). Користите хипергеометријски Фишеров егзактни тест (ФЕТ) (доле) да процените повезаност типа ћелије за сваки протеински модул. Интензитет црвеног сенчења указује на степен обогаћивања типа ћелије, а звездица означава статистичку значајност (П <0,05). Користите БХ метод да исправите П вредност изведену из ФЕТ-а. (Ц) ГО анализа модуларних протеина. Најближи биолошки процеси су приказани за сваки модул или сродну групу модула. олиго, олигодендроцит.
Скуп од пет блиско повезаних модула богатих астроцитима и микроглијама (М30, М29, М18, М24 и М5) показао је снажну позитивну корелацију са неуропатологијом АД (Слика 2Б). Онтолошка анализа повезује ове глијалне модуле са растом ћелија, пролиферацијом и имунитетом (слика 2Ц и табела С2Е). Два додатна глијална модула, М8 и М22, такође су снажно појачана код болести. М8 је у великој мери повезан са путањом рецептора налик Толлу, сигналном каскадом која игра кључну улогу у урођеном имунолошком одговору (30). Истовремено, М22 је уско повезан са посттранслационом модификацијом. М2, који је богат олигодендроцитима, показује снажну позитивну корелацију са патологијом АД и онтолошку везу са синтезом нуклеозида и репликацијом ДНК, што указује на појачану пролиферацију ћелија у болестима. Све у свему, ови налази подржавају елевацију глијалних модула које смо претходно приметили у протеому АД мреже (13, 17). Тренутно је утврђено да многи глијални модули повезани са АД у мрежи показују ниже нивое експресије у контролним и ПД случајевима, наглашавајући њихову специфичност болести која је повишена у АД (Слика С2Ц).
Само четири модула у нашем мрежном протеому (М1, М3, М10 и М32) су у снажној негативној корелацији са патологијом АД (П <0,05) (Слика 2, Б и Ц). И М1 и М3 су богати неуронским маркерима. М1 је у великој мери повезан са синаптичким сигналима, док је М3 уско повезан са функцијом митохондрија. Нема доказа о обогаћивању типа ћелије за М10 и М32. М32 одражава везу између М3 и ћелијског метаболизма, док је М10 у великој мери повезан са растом ћелије и функцијом микротубула. У поређењу са АД, сва четири модула су повећана у контроли и ПД, дајући им АД промене специфичне за болест (Слика С2Ц). Све у свему, ови резултати подржавају смањену количину модула богатих неуронима које смо раније приметили у АД (13, 17). Укратко, мрежна анализа протеома мозга коју смо открили произвела је АД-специфично измењене модуле у складу са нашим претходним налазима.
АД карактерише рана асимптоматска фаза (АсимАД), у којој појединци показују акумулацију амилоида без клиничког когнитивног пада (5, 31). Ова асимптоматска фаза представља критичан прозор за рано откривање и интервенцију. Раније смо демонстрирали снажно модуларно очување протеома АсимАД и АД мождане мреже у независним скуповима података (13, 17). Како бисмо осигурали да је мрежа мозга коју смо тренутно открили у складу са овим претходним налазима, анализирали смо очување 44 модула у реплицираном скупу података из 27 ДЛПФЦ организација. Ове организације укључују случајеве контроле (н = 10), АсимАД (н = 8) и АД (н = 9). Контролни и АД узорци су укључени у анализу наше кохорте мозга открића (Табела С1Б), док су случајеви АсимАД-а били јединствени само у кохорти репликације. Ови АсимАД случајеви су такође дошли из Емори Гоизуета АДРЦ банке мозга. Иако је когниција била нормална у време смрти, нивои амилоида су били абнормално високи (средња вредност ЦЕРАД, 2,8 ± 0,5) (Табела С1Б).
ТМТ-МС анализа ових 27 можданих ткива резултирала је квантификацијом 11.244 протеома. Ово коначно бројање укључује само оне протеине квантификоване у најмање 50% узорака. Овај реплицирани скуп података садржи 8638 (98,0%) од 8817 протеина откривених у нашој анализи мозга открића, и има скоро 3000 значајно промењених протеина између контролне и АД кохорте (П <0,05, након Тукеи-овог упареног т теста за анализу варијансе) ( Табела С2Ф). Међу овим различито експримираним протеинима, 910 је такође показао значајне промене нивоа између АД и контролних случајева протеома мозга (П <0,05, након АНОВА Тукеи упареног т-теста). Вреди напоменути да су ови маркери 910 веома конзистентни у смеру промене између протеома (р = 0,94, П <1,0 × 10-200) (слика С3А). Међу повећаним протеинима, протеини са најдоследнијим променама између скупова података су углавном чланови модула М5 и М18 богатих глијама (МДК, ЦОЛ25А1, МАПТ, НТН1, СМОЦ1 и ГФАП). Међу редукованим протеинима, они са најконзистентнијим променама били су скоро искључиво чланови М1 модула (НПТКС2, ВГФ и РПХ3А) који су повезани са синапсом. Даље смо верификовали промене у вези са АД мидкине (МДК), ЦД44, излученог протеина 1 (СФРП1) и ВГФ-а (слика С3Б). Анализа очувања модула је показала да је око 80% протеинских модула (34/44) у протеому мозга значајно очувано у скупу података о репликацији (з-сцоре> 1,96, ФДР коригован П <0,05) (Слика С3Ц). Четрнаест од ових модула је било посебно резервисано између два протеома (з-сцоре> 10, ФДР коригован П <1,0 × 10-23). Све у свему, откриће и репликација високог степена конзистентности у диференцијалној експресији и модуларној композицији између протеома мозга наглашава репродуктивност промена у протеинима фронталног кортекса АД. Поред тога, такође је потврђено да АсимАД и напредније болести имају веома сличну структуру мождане мреже.
Детаљнија анализа диференцијалне експресије у скупу података о репликацији мозга наглашава значајан степен промена АсимАД протеина, укључујући укупно 151 значајно промењен протеин између АсимАД-а и контроле (П <0,05) (Слика С3Д). У складу са амилоидним оптерећењем, АПП у мозгу АсимАД-а и АД значајно се повећао. МАПТ се значајно мења само у АД, што је у складу са повећаним нивоима запетљаности и његовом познатом корелацијом са когнитивним падом (5, 7). Модули богати глијама (М5 и М18) се у великој мери одражавају на повећане протеине у АсимАД-у, док је М1 модул повезан са неуронима најрепрезентативнији од смањених протеина у АсимАД-у. Многи од ових АсимАД маркера показују веће промене у симптоматским болестима. Међу овим маркерима је СМОЦ1, глијални протеин који припада М18, који је повезан са туморима мозга и развојем очију и удова (32). МДК је фактор раста који везује хепарин који се односи на раст ћелија и ангиогенезу (33), још један члан М18. У поређењу са контролном групом, АсимАД се значајно повећао, праћен већим повећањем АД. Насупрот томе, синаптички протеин неуропентраксин 2 (НПТКС2) је значајно смањен у мозгу АсимАД. НПТКС2 је раније био повезан са неуродегенерацијом и има признату улогу у посредовању ексцитаторних синапси (34). Све у свему, ови резултати откривају низ различитих претклиничких промена протеина у АД за које се чини да напредују са тежином болести.
С обзиром да смо у открићу протеома мозга постигли значајну дубину покривености протеинима, покушавамо да потпуније разумемо његово преклапање са АД транскриптомом на нивоу мреже. Стога смо упоредили протеом мозга који смо открили са модулом који смо претходно генерисали мерењем микромрежа 18.204 гена у АД (н = 308) и контролним (н = 157) ДЛПФЦ ткивима (13). преклапање. Укупно смо идентификовали 20 различитих РНК модула, од којих су многи показали обогаћивање специфичних типова ћелија, укључујући неуроне, олигодендроците, астроците и микроглију (слика 3А). Вишеструке промене ових модула у АД приказане су на слици 3Б. У складу са нашом претходном анализом преклапања протеина и РНК користећи дубље необележене МС протеоме (око 3000 протеина) (13), већина од 44 модула у мрежи протеома мозга које смо пронашли налази се у мрежи транскриптома. Нема значајног преклапања. Чак и у наше откриће и репликација 34 протеинска модула који су високо задржани у протеому мозга, само 14 (~40%) је прошло Фишеров егзактни тест (ФЕТ) показало се да има статистички значајно преклапање са транскриптомом (Слика 3А). Компатибилан са поправком оштећења ДНК (П-М25 и П-М19), транслацијом протеина (П-М7 и П-М20), везивањем/спајањем РНК (П-М16 и П-М21) и циљањем протеина (П-М13 и П- М23) се не преклапа са модулима у транскриптому. Стога, иако се у тренутној анализи преклапања користи дубљи скуп података о протеому (13), већина протеома АД мреже није мапирана у мрежу транскриптома.
(А) Хипергеометријски ФЕТ показује обогаћивање маркера специфичних за тип ћелије у РНК модулу АД транскриптома (горе) и степен преклапања између РНК (к-оса) и протеина (и-оса) модула АД мозга (доле) . Интензитет црвеног сенчења указује на степен обогаћивања типова ћелија у горњем панелу и интензитет преклапања модула у доњем панелу. Звездице означавају статистичку значајност (П <0,05). (Б) Степен корелације између карактеристичних гена сваког модула транскриптома и статуса АД. Модули са леве стране су у најнегативнијој корелацији са АД (плави), а они са десне стране су у најпозитивнијој корелацији са АД (црвени). Лог-трансформисана БХ-коригована П вредност указује на степен статистичке значајности сваке корелације. (Ц) Значајно преклапање модула са заједничким обогаћивањем типа ћелије. (Д) Корелациона анализа лог2 пута промене обележеног протеина (к-оса) и РНК (и-оса) у модулу који се преклапа. Приказује се Пирсонов коефицијент корелације са релевантном П вредношћу. Микро, микроглија; небеска тела, астроцити. ЦТ, контрола.
Већина модула протеина и РНК који се преклапају имају сличне профиле обогаћивања типа ћелија и конзистентне смерове промене АД (Слика 3, Б и Ц). Другим речима, М1 модул можданог протеома (ПМ1) повезан са синапсом је мапиран на три хомологна РНК модула богата неуронима (Р-М1, Р-М9 и Р-М16), који се налазе у АД. смањен ниво. Слично, модули протеина М5 и М18 богати глијама преклапају се са РНК модулима богатим астроцитима и микроглијалним маркерима (Р-М3, Р-М7 и Р-М10) и веома су укључени у повећање болести. Ове заједничке модуларне карактеристике између два скупа података додатно подржавају обогаћивање ћелијског типа и промене повезане са болестима које смо приметили у протеому мозга. Међутим, приметили смо многе значајне разлике између нивоа РНК и протеина појединачних маркера у овим заједничким модулима. Корелациона анализа диференцијалне експресије протеомике и транскриптомике молекула унутар ових преклапајућих модула (Слика 3Д) наглашава ову недоследност. На пример, АПП и неколико других протеина глијалног модула (НТН1, МДК, ЦОЛ25А1, ИЦАМ1 и СФРП1) показали су значајно повећање АД протеома, али скоро да није било промене у АД транскриптому. Ове промене специфичне за протеин могу бити уско повезане са амилоидним плаковима (23, 35), истичући протеом као извор патолошких промена, а ове промене се можда неће одразити у транскриптому.
Након независне анализе мозга и протеома ЦСФ које смо открили, спровели смо свеобухватну анализу два скупа података да бисмо идентификовали биомаркере АД ЦСФ који се односе на патофизиологију мождане мреже. Прво морамо дефинисати преклапање два протеома. Иако је широко прихваћено да ЦСФ одражава неурохемијске промене у АД мозгу (4), тачан степен преклапања између АД мозга и ЦСФ протеома је нејасан. Упоређивањем броја заједничких генских производа откривених у наша два протеома, открили смо да је скоро 70% (н = 1936) протеина идентификованих у цереброспиналној течности такође квантификовано у мозгу (Слика 4А). Већина ових преклапајућих протеина (н = 1721) мапирана је у један од 44 модула коекспресије из скупа података о открићу мозга (Слика 4Б). Као што се очекивало, шест највећих можданих модула (М1 до М6) показало је највећу количину ЦСФ преклапања. Међутим, постоје мањи мождани модули (на пример, М15 и М29) који постижу неочекивано висок степен преклапања, већи од модула мозга који је дупло већи од његове величине. Ово нас мотивише да усвојимо детаљнији, статистички вођен метод за израчунавање преклапања између мозга и цереброспиналне течности.
(А и Б) Протеини откривени у мозгу открића и скуповима података ЦСФ се преклапају. Већина ових преклапајућих протеина је повезана са једним од 44 коекспресиона модула мреже коекспресије мозга. (Ц) Откријте преклапање између протеома цереброспиналне течности и протеома мождане мреже. Сваки ред топлотне карте представља засебну анализу преклапања хипергеометријског ФЕТ-а. Горњи ред приказује преклапање (сиво/црно сенчење) између можданог модула и целог протеома ЦСФ. Друга линија приказује да је преклапање између можданих модула и протеина ЦСФ (осенчено црвеном бојом) значајно повећано у АД (П <0,05). Трећи ред показује да је преклапање између можданих модула и ЦСФ протеина (плаво сенчење) значајно смањено у АД (П <0,05). Користите БХ метод да исправите П вредност изведену из ФЕТ-а. (Д) Преклопни панел модула заснован на асоцијацији типа ћелије и сродним ГО терминима. Ови панели садрже укупно 271 протеина у вези са мозгом, који имају значајну диференцијалну експресију у протеому ЦСФ.
Користећи једностране ФЕТ-ове, проценили смо важност преклапања протеина између ЦСФ протеома и појединачних можданих модула. Анализа је открила да укупно 14 можданих модула у скупу података ЦСФ има статистички значајна преклапања (ФДР прилагођен П <0,05) и додатни модул (М18) чије је преклапање близу значаја (ФДР прилагођен П = 0,06) (Слика 4Ц , горњи ред). Такође смо заинтересовани за модуле који се снажно преклапају са различито експримираним ЦСФ протеинима. Стога смо применили две додатне ФЕТ анализе да бисмо утврдили који од (и) ЦСФ протеина је значајно повећан у АД и (ии) ЦСФ протеин је значајно смањен у АД (П <0,05, упарени т тест АД/контрола) Модули мозга са значајним преклапањем између њих. Као што је приказано у средњем и доњем реду слике 4Ц, ове додатне анализе показују да се 8 од 44 мождана модула значајно преклапају са протеином додатим у АД ЦСФ (М12, М1, М2, М18, М5, М44, М33 и М38) . ), док су само два модула (М6 и М15) показала значајно преклапање са смањеним протеином у АД ЦСФ. Као што се очекивало, свих 10 модула је у 15 модула са највећим преклапањем са ЦСФ протеомом. Због тога претпостављамо да су ових 15 модула извори високог приноса биомаркера ЦСФ добијених из мозга АД.
Ових 15 модула који се преклапају саставили смо у пет великих протеинских панела на основу њихове близине у дијаграму дрвета ВГЦНА и њихове повезаности са типовима ћелија и онтологијом гена (слика 4Д). Први панел садржи модуле богате неуронским маркерима и протеинима везаним за синапсе (М1 и М12). Синаптички панел садржи укупно 94 протеина, а нивои у ЦСФ протеому су се значајно променили, што га чини највећим извором ЦСФ маркера повезаних са мозгом међу пет панела. Друга група (М6 и М15) показала је блиску везу са маркерима ендотелних ћелија и васкуларним телом, као што су „зацељивање рана” (М6) и „регулација хуморалног имуног одговора” (М15). М15 је такође веома повезан са метаболизмом липопротеина, који је уско повезан са ендотелијумом (36). Васкуларни панел садржи 34 ЦСФ маркера који се односе на мозак. Трећа група обухвата модуле (М2 и М4) који су значајно повезани са маркерима олигодендроцита и пролиферацијом ћелија. На пример, термини онтологије највишег нивоа М2 укључују „позитивну регулацију репликације ДНК“ и „процес биосинтезе пурина“. У међувремену, они код М4 укључују „диференцијацију глијалних ћелија“ и „сегрегацију хромозома“. Панел за мијелинизацију садржи 49 ЦСФ маркера који се односе на мозак.
Четврта група садржи највише модула (М30, М29, М18, М24 и М5), а скоро сви модули су значајно богати микроглијама и маркерима астроцита. Слично панелу за мијелинизацију, четврти панел такође садржи модуле (М30, М29 и М18) који су уско повезани са пролиферацијом ћелија. Остали модули у овој групи су веома повезани са имунолошким терминима, као што су „процес имунолошког ефекта“ (М5) и „регулација имунолошког одговора“ (М24). Глијална имунска група садржи 42 ЦСФ маркера који се односе на мозак. Коначно, последњи панел укључује 52 маркера у вези са мозгом на четири модула (М44, М3, М33 и М38), а сви су на телу повезани са складиштењем енергије и метаболизмом. Највећи од ових модула (М3) је уско повезан са митохондријама и богат је маркерима специфичним за неуроне. М38 је један од мањих чланова модула у овом метаболому и такође показује умерену неуронску специфичност.
Све у свему, ових пет панела одражавају широк спектар типова ћелија и функција у кортексу АД, и заједно садрже 271 ЦСФ маркера који се односи на мозак (Табела С2Г). Да бисмо проценили валидност ових МС резултата, користили смо тест проширења близине (ПЕА), ортогоналну технологију засновану на антителима са могућностима мултиплексирања, високом осетљивошћу и специфичношћу, и поново анализирали узорке цереброспиналне течности за које смо пронашли подскуп од ових 271 биомаркера (н = 36). Ових 36 циљева показују промену АД вишеструког ПЕА, што је уско повезано са нашим налазима заснованим на МС (р = 0,87, П = 5,6 × 10-12), што је снажно потврдило резултате наше свеобухватне МС анализе (Слика С4 ).
Биолошке теме које наглашавају наших пет група, од синаптичке сигнализације до енергетског метаболизма, све су повезане са патогенезом АД (1-3). Према томе, свих 15 модула који садрже ове панеле су повезани са АД патологијом у протеому мозга који смо открили (слика 2Б). Најзначајнија је висока позитивна патолошка корелација између наших глијалних модула и јака негативна патолошка корелација између наших највећих неуронских модула (М1 и М3). Анализа диференцијалне експресије нашег реплицираног протеома мозга (слика С3Д) такође наглашава глијалне протеине изведене из М5 и М18. Код АсимАД-а и симптоматског АД, највише су повећани глијални протеини и синапсе повезане са М1. Протеин је највише смањен. Ова запажања указују да је 271 маркер цереброспиналне течности које смо идентификовали у пет група повезан са процесима болести у кортексу АД, укључујући и оне који се јављају у раним асимптоматским стадијумима.
Да бисмо боље анализирали правац промене протеина панела у мозгу и кичменој течности, нацртали смо следеће за сваки од 15 преклапајућих модула: (и) пронашли ниво изобиља модула у скупу података о мозгу и (ии) модул протеин Разлика је изражена у цереброспиналној течности (слика С5). Као што је раније поменуто, ВГЦНА се користи за одређивање количине модула или карактеристичне вредности протеина у мозгу (13). Мапа вулкана се користи за описивање диференцијалне експресије модуларних протеина у цереброспиналној течности (АД/контрола). Ове бројке показују да три од пет панела показују различите трендове експресије у мозгу и кичменој течности. Два модула синапсног панела (М1 и М12) показују смањење нивоа обиља у АД мозгу, али се значајно преклапају са повећаним протеином у АД ЦСФ (слика С5А). Модули везани за неуроне који садрже метаболом (М3 и М38) показали су да су слични облици експресије мозга и цереброспиналне течности недоследни (слика С5Е). Васкуларни панел је такође показао различите трендове експресије, иако су његови модули (М6 и М15) умерено повећани у АД мозгу и смањени у болесној ЦСФ (слика С5Б). Преостала два панела садрже велике глијалне мреже чији су протеини доследно регулисани навише у оба одељка (Слика С5, Ц и Д).
Имајте на уму да ови трендови нису заједнички за све маркере на овим панелима. На пример, синаптички панел укључује неколико протеина који су значајно смањени у АД мозгу и ЦСФ (слика С5А). Међу овим наниже регулисаним маркерима цереброспиналне течности су НПТКС2 и ВГФ од М1, и хромогранин Б од М12. Међутим, упркос овим изузецима, већина наших синаптичких маркера је повишена у АД кичменој течности. Све у свему, ове анализе су биле у стању да разликују статистички значајне трендове у нивоу мозга и цереброспиналне течности у сваком од наших пет панела. Ови трендови наглашавају сложен и често различит однос између експресије протеина мозга и ЦСФ-а у АД.
Затим смо користили анализу репликације МС високе пропусности (ЦСФ репликација 1) да бисмо сузили наш 271 скуп биомаркера на најперспективније и поновљиве циљеве (Слика 5А). ЦСФ копија 1 садржи укупно 96 узорака из Емори Гоизуета АДРЦ, укључујући контролну, АсимАД и АД кохорту (Табела С1А). Ове случајеве АД карактерише благи когнитивни пад (средња вредност МоЦА, 20,0 ± 3,8) и промене у биомаркерима АД потврђене у цереброспиналној течности (Табела С1А). За разлику од ЦСФ анализе коју смо открили, ова репликација се изводи коришћењем ефикасније и продуктивније „сингле-схот“ МС методе (без офф-лине фракционисања), укључујући поједностављени протокол припреме узорка који елиминише потребу за имунодеплецијом појединачних узорака . Уместо тога, користи се један „канал за појачавање“ осиромашеног имунитета за појачавање сигнала мање заступљених протеина (37). Иако смањује укупну покривеност протеомом, овај метод са једним ударцем значајно смањује време рада машине и повећава број узорака обележених ТМТ који се могу анализирати као одрживи (17, 38). Укупно, анализа је идентификовала 6.487 пептида, који су мапирани на 1.183 протеома у 96 случајева. Као и код анализе ликвора коју смо открили, само они протеини квантификовани у најмање 50% узорака су укључени у наредне прорачуне, а подаци су регресирани за ефекте старости и пола. Ово је довело до коначне квантификације 792 протеома, од којих је 95% такође идентификовано у пронађеном скупу података ЦСФ.
(А) Циљеви протеина ЦСФ везани за мозак верификовани у првој реплицираној кохорти ЦСФ и укључени у завршни панел (н = 60). (Б до Е) Нивои биомаркера панела (композитни з-резултати) мерени у четири кохорте репликације ЦСФ. Упарени т-тестови или АНОВА са Тукеи-овом накнадном корекцијом коришћени су за процену статистичке значајности промена у обиљу у свакој поновљеној анализи. ЦТ, контрола.
Пошто смо посебно заинтересовани за верификацију нашег 271 циља ЦСФ-а повезаних са мозгом кроз свеобухватну анализу, ограничићемо даље испитивање овог реплицираног протеома на ове маркере. Међу овим 271 протеином, 100 је откривено у ЦСФ репликацији 1. Слика С6А приказује диференцијалну експресију ових 100 преклапајућих маркера између контролних и АД узорака репликације. Синаптички и метаболички хистони се највише повећавају у АД, док се васкуларни протеини највише смањују у болести. Већина од 100 преклапајућих маркера (н = 70) задржала је исти смер промене у два скупа података (слика С6Б). Ових 70 валидираних ЦСФ маркера повезаних са мозгом (Табела С2Х) у великој мери одражавају претходно уочене трендове експресије панела, то јест, нижу регулацију васкуларних протеина и повећање регулације свих осталих панела. Само 10 од ових 70 валидираних протеина показало је промене у обиљу АД које су биле у супротности са овим панел трендовима. Да бисмо генерисали панел који најбоље одражава укупан тренд мозга и цереброспиналне течности, искључили смо ових 10 протеина из панела од интереса који смо коначно верификовали (Слика 5А). Стога, наш панел на крају укључује укупно 60 протеина верификованих у две независне кохорте ЦСФ АД користећи различите припреме узорака и анализу МС платформе. Графичке експресије з-скора ових завршних панела у контролној копији 1 ЦСФ-а и случајевима АД потврдиле су тренд панела уочен у кохорти ЦСФ-а коју смо пронашли (Слика 5Б).
Међу ових 60 протеина, постоје молекули за које се зна да су повезани са АД, као што је остеопонтин (СПП1), који је проинфламаторни цитокин који је повезан са АД у многим студијама (39-41), и ГАП43, синаптички протеин што је јасно повезано са неуродегенерацијом (42). Најпотпуније верификовани протеини су маркери који се односе на друге неуродегенеративне болести, као што су супероксид дисмутаза 1 (СОД1) повезана са амиотрофичном латералном склерозом (АЛС) и десахараза повезана са Паркинсоновом болешћу (ПАРК7). Такође смо потврдили да многи други маркери, као што су СМОЦ1 и сигнални протеин 1 за везивање мембране богате мозгом (БАСП1), имају ограничене претходне везе са неуродегенерацијом. Вреди напоменути да нам је због њихове ниске укупне заступљености у протеому ЦСФ-а, тешко да користимо ову методу детекције са једним ударцем високе пропусности да бисмо поуздано открили МАПТ и одређене друге протеине повезане са АД (на пример, НЕФЛ и НРГН ) (43, 44).
Затим смо проверили ових 60 приоритетних маркера панела у три додатне анализе. У копији ЦСФ 2, користили смо један ТМТ-МС да анализирамо независну кохорту од 297 контролних и АД узорака из Емори Гоизуета АДРЦ (17). ЦСФ репликација 3 укључивала је поновну анализу доступних ТМТ-МС података од 120 контролних пацијената и пацијената са АД из Лозане, Швајцарска (45). Открили смо више од две трећине од 60 приоритетних маркера у сваком скупу података. Иако је швајцарска студија користила различите МС платформе и методе квантификације ТМТ (45, 46), ми смо снажно репродуковали наше трендове панела у две поновљене анализе (Слика 5, Ц и Д, и табеле С2, И и Ј). Да бисмо проценили специфичност болести наше групе, користили смо ТМТ-МС за анализу четвртог скупа података о репликацији (ЦСФ репликација 4), који је укључивао не само контролне (н = 18) и АД (н = 17) случајеве, већ и ПД ( н = 14)), АЛС (н = 18) и узорци фронтотемпоралне деменције (ФТД) (н = 11) (Табела С1А). Успешно смо квантификовали скоро две трећине протеина панела у овој кохорти (38 од 60). Ови резултати истичу промене специфичне за АД у свих пет панела биомаркера (слика 5Е и табела С2К). Повећање групе метаболита показало је најјачу АД специфичност, праћено мијелинизацијом и глијалном групом. У мањој мери, ФТД такође показује повећање између ових панела, што може одражавати сличне потенцијалне промене мреже (17). Насупрот томе, АЛС и ПД су показали скоро исте профиле мијелинизације, глија и метаболома као и контролна група. Све у свему, упркос разликама у припреми узорака, МС платформи и методама квантификације ТМТ, ове поновљене анализе показују да наши приоритетни панел маркери имају веома конзистентне промене специфичне за АД у више од 500 јединствених ЦСФ узорака.
Неуродегенерација АД је широко призната неколико година пре појаве когнитивних симптома, тако да постоји хитна потреба за биомаркерима АсимАД-а (5, 31). Међутим, све више и више доказа показује да је биологија АсимАД-а далеко од хомогене, а сложена интеракција ризика и отпорности доводи до великих индивидуалних разлика у каснијој прогресији болести (47). Иако се користе за идентификацију случајева АсимАД-а, нивои кључних биомаркера ЦСФ (Аβ1-42, укупни тау и п-тау) нису се показали као у стању да поуздано предвиде ко ће напредовати до деменције (4, 7), што указује на више. неопходно је укључити холистичке алате за биомаркере засноване на вишеструким аспектима физиологије мозга како би се тачно стратифицирао ризик ове популације. Стога смо накнадно анализирали наш панел биомаркера који је потврдио АД у АсимАД популацији ЦСФ копије 1. Ових 31 случај АсимАД показао је абнормалне нивое биомаркера (Аβ1–42/укупни тау ЕЛИСА однос, <5,5) и потпуну спознају (средња вредност МоЦА, 27,1 ± 2.2) (Табела С1А). Поред тога, све особе са АсимАД-ом имају оцену клиничке деменције од 0, што указује да нема доказа о паду дневних когнитивних или функционалних перформанси.
Прво смо анализирали нивое валидираних панела у свих 96 ЦСФ реплика 1, укључујући АсимАД кохорту. Открили смо да је неколико панела у АсимАД групи имало значајне промене у обиљу налик АД, васкуларни панел је показао опадајући тренд у АсимАД-у, док су сви остали панели показали узлазни тренд (Слика 6А). Стога су сви панели показали високо значајну корелацију са ЕЛИСА Аβ1-42 и укупним нивоима тау (Слика 6Б). Насупрот томе, корелација између групе и МоЦА резултата је релативно лоша. Један од најупечатљивијих налаза из ових анализа је велики распон броја панела у АсимАД кохорти. Као што је приказано на слици 6А, ниво панела АсимАД групе обично прелази ниво панела контролне групе и АД групе, показујући релативно велику варијабилност. Да бисмо даље истражили ову хетерогеност АсимАД-а, применили смо анализу вишедимензионалног скалирања (МДС) на 96 случајева репликације ЦСФ 1. МДС анализа омогућава визуализацију сличности између случајева на основу одређених варијабли у скупу података. За ову кластер анализу користимо само оне валидиране панел маркере који имају статистички значајну промену (П <0,05, АД/контрола) на нивоу откривања и репликације 1 протеома ЦСФ (н = 29) (Табела С2Л). Ова анализа је произвела јасно просторно груписање између наших контролних и АД случајева (слика 6Ц). Насупрот томе, неки случајеви АсимАД-а су јасно групирани у контролној групи, док су други лоцирани у случајевима АД. Да бисмо даље истражили ову хетерогеност АсимАД-а, користили смо нашу МДС мапу да дефинишемо две групе ових АсимАД случајева. Прва група је укључивала случајеве АсимАД груписане ближе контроли (н = 19), док су другу групу карактерисали случајеви АсимАД са профилом маркера ближим АД (н = 12).
(А) Ниво експресије (з-сцоре) групе биомаркера ЦСФ у свих 96 узорака у кохорти репликације ЦСФ 1, укључујући АсимАД. Анализа варијансе са Тукеи-овом накнадном корекцијом коришћена је за процену статистичке значајности промена у обиљу панела. (Б) Анализа корелације нивоа заступљености протеина на панелу (з-сцоре) са МоЦА скором и укупним тау нивоом у ЕЛИСА Аβ1-42 и ЦСФ копији 1 узорцима. Приказује се Пирсонов коефицијент корелације са релевантном П вредношћу. (Ц) МДС за 96 случајева копије 1 ЦСФ-а заснован је на нивоима распрострањености 29 валидираних панел маркера, који су значајно промењени у скуповима података за откривање и копију ЦСФ 1 [П <0,05 АД/контрола (ЦТ)]. Ова анализа је коришћена да се АсимАД група подели на контролну (н = 19) и АД (н = 12) подгрупу. (Д) Графикон вулкана показује диференцијалну експресију свих протеина репликације 1 ЦСФ-а са променом лог2 пута (к-оса) у односу на -лог10 статистичку П вредност између две АсимАД подгрупе. Биомаркери панела су обојени. (Е) Ниво распрострањености ЦСФ репликације 1 биомаркера селекционе групе је различито изражен између АсимАД подгрупа. За процену статистичке значајности коришћена је Тукијева пост-прилагођена анализа варијансе.
Испитали смо диференцијалну експресију протеина између ових контролних и случајева АсимАД сличних АД (слика 6Д и табела С2Л). Резултирајућа мапа вулкана показује да се 14 ознака на панелима значајно променило између две групе. Већина ових маркера су чланови синапсе и метаболома. Међутим, СОД1 и миристоиловани супстрат Ц протеин киназе богат аланином (МАРЦКС), који су чланови мијелинске и глијалне имунолошке групе, такође припадају овој групи (Слика 6, Д и Е). Васкуларни панел је такође допринео два маркера који су значајно смањени у групи АсимАД налик АД, укључујући АЕ везујући протеин 1 (АЕБП1) и члана породице комплемента Ц9. Није било значајне разлике између контролне и АсимАД подгрупе сличне АД у ЕЛИСА АБ1-42 (П = 0,38) и п-тау (П = 0,28), али је заиста постојала значајна разлика у укупном тау нивоу (П = 0,0031 ) (Сл. С7). Постоји неколико маркера панела који указују на то да су промене између две АсимАД подгрупе значајније од укупних тау нивоа (на пример, ИВХАЗ, СОД1 и МДХ1) (Слика 6Е). Све у свему, ови резултати указују на то да наш валидирани панел може садржати биомаркере који могу подтиповати и потенцијалну стратификацију ризика пацијената са асимптоматском болешћу.
Постоји хитна потреба за системским биомаркерским алатима за боље мерење и циљање различите патофизиологије иза АД. Очекује се да ови алати не само да промене наш дијагностички оквир АД, већ и промовишу усвајање ефикасних стратегија лечења специфичних за пацијенте (1, 2). У том циљу, применили смо непристрасан свеобухватни протеомички приступ на АД мозак и ЦСФ да бисмо идентификовали биомаркере ЦСФ засноване на вебу који одражавају широк спектар патофизиологије засноване на мозгу. Наша анализа произвела је пет панела биомаркера ЦСФ, који (и) одражавају синапсе, крвне судове, мијелин, имунолошку и метаболичку дисфункцију; (ии) показати снажну поновљивост на различитим платформама МС; (иии) Показати прогресивне промене специфичне за болест током раних и касних стадијума АД. Све у свему, ови налази представљају обећавајући корак ка развоју разноврсних, поузданих, веб оријентисаних алата за биомаркере за истраживање АД и клиничке примене.
Наши резултати показују високо очувану организацију протеома АД мождане мреже и подржавају његову употребу као сидро за развој биомаркера заснованог на систему. Наша анализа показује да два независна ТМТ-МС скупа података који садрже АД и АсимАД мозгове имају јаку модуларност. Ови налази проширују наш претходни рад, показујући очување моћних модула више од 2.000 можданих ткива из више независних кохорти у фронталном, паријеталном и темпоралном кортексу (17). Ова мрежа консензуса одражава различите промене у вези са болестима које су примећене у тренутним истраживањима, укључујући повећање инфламаторних модула богатих глијама и смањење модула богатих неуронима. Као и тренутна истраживања, ова велика мрежа такође има значајне модуларне промене у АсимАД-у, показујући низ различитих претклиничких патофизиологија (17).
Међутим, унутар овог високо конзервативног оквира заснованог на систему, постоји више фино зрнасте биолошке хетерогености, посебно међу појединцима у раним фазама АД. Наш панел биомаркера је у стању да прикаже две подгрупе у АсимАД-у, које показују значајну диференцијалну експресију више ЦСФ маркера. Наша група је успела да истакне биолошке разлике између ове две подгрупе, које нису биле очигледне на нивоу кључних АД биомаркера. У поређењу са контролном групом, Аβ1-42/укупни тау односи ових АсимАД појединаца су били абнормално ниски. Међутим, само су се укупни нивои тау значајно разликовали између две АсимАД подгрупе, док су нивои Аβ1-42 и п-тау остали релативно упоредиви. Пошто се чини да је висок ЦСФ тау бољи предиктор когнитивних симптома од нивоа Аβ1-42 (7), сумњамо да две кохорте АсимАД-а могу имати различите ризике од прогресије болести. С обзиром на ограничену величину узорка нашег АсимАД-а и недостатак лонгитудиналних података, потребна су даља истраживања да би се са сигурношћу извукли ови закључци. Међутим, ови резултати указују да панел ЦСФ заснован на систему може побољшати нашу способност да ефикасно стратификујемо појединце током асимптоматског стадијума болести.
Све у свему, наши налази подржавају улогу вишеструких биолошких функција у патогенези АД. Међутим, нерегулисани енергетски метаболизам постао је истакнута тема свих наших пет валидираних панела за означавање. Метаболички протеини, као што су хипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза 1 (ХПРТ1) и лактат дехидрогеназа А (ЛДХА), су најстроже потврђени синаптички биомаркери, што указује на то да је повећање АД ЦСФ-а веома репродуцибилан пол. Наши крвни судови и глијални панели такође садрже неколико маркера укључених у метаболизам оксидативних супстанци. Ови налази су у складу са кључном улогом коју метаболички процеси играју у целом мозгу, не само да би се задовољиле високе енергетске потребе неурона, већ и да би се задовољиле високе енергетске потребе астроцита и других глијалних ћелија (17, 48). Наши резултати подржавају све већи број доказа да промене у редокс потенцијалу и прекид енергетских путева могу бити кључна веза између неколико кључних процеса укључених у патогенезу АД, укључујући митохондријалне поремећаје, упалу посредовану глијама и васкуларно оштећење (49). Поред тога, метаболички биомаркери цереброспиналне течности садрже велики број различито богатих протеина између наше контролне и АсимАД подгрупе сличне АД, што сугерише да поремећај ових енергетских и редокс путева може бити критичан у претклиничкој фази болести.
Различити трендови панела мозга и цереброспиналне течности које смо приметили такође имају занимљиве биолошке импликације. Синапсе и метаболоми богати неуронима показују смањене нивое у мозгу АД и повећану количину у цереброспиналној течности. С обзиром на то да су неурони богати митохондријама које производе енергију у синапсама како би обезбедиле енергију за своје бројне специјализоване сигнале (50), очекује се сличност профила експресије ове две групе неурона. Губитак неурона и екструзија оштећених ћелија могу да објасне ове трендове на мозгу и ЦСФ панела у каснијим обољењима, али не могу да објасне ране промене панела које примећујемо (13). Једно од могућих објашњења за ове налазе у раној асимптоматској болести је абнормално синаптичко орезивање. Нови докази на моделима мишева сугеришу да синаптичка фагоцитоза посредована микрогијом може бити ненормално активирана у АД и довести до раног губитка синапсе у мозгу (51). Овај одбачени синаптички материјал може се акумулирати у ЦСФ, због чега посматрамо повећање ЦСФ у неуронском панелу. Имунски посредовано синаптичко орезивање такође може делимично објаснити повећање глијалних протеина које примећујемо у мозгу и цереброспиналној течности током процеса болести. Поред синаптичког орезивања, укупне абнормалности у егзоцитном путу такође могу довести до различитих експресија неуронских маркера у мозгу и ЦСФ. Бројна истраживања су показала да се садржај егзозома у патогенези АД мозга променио (52). Екстрацелуларни пут је такође укључен у пролиферацију Аβ (53, 54). Вреди напоменути да супресија егзосомалне секреције може смањити патологију сличну АД код трансгених мишјих модела АД (55).
Истовремено, протеин у васкуларном панелу показао је умерено повећање АД мозга, али значајно смањен у ЦСФ. Дисфункција крвно-мождане баријере (БББ) може делимично да објасни ове налазе. Многе независне постморталне студије на људима су показале распад БББ у АД (56, 57). Ове студије су потврдиле различите абнормалне активности око овог чврсто затвореног слоја ендотелних ћелија, укључујући цурење можданих капилара и периваскуларно накупљање протеина који се преносе крвљу (57). Ово може пружити једноставно објашњење за повишене васкуларне протеине у мозгу, али не може у потпуности објаснити исцрпљивање ових истих протеина у цереброспиналној течности. Једна од могућности је да централни нервни систем активно изолује ове молекуле како би решио проблем повећане упале и оксидативног стреса. Смањење неких од најтежих ЦСФ протеина у овом панелу, посебно оних који су укључени у регулацију липопротеина, повезано је са инхибицијом штетних нивоа инфламације и неуропротективног процеса реактивних врста кисеоника. Ово важи за пароксоназу 1 (ПОН1), ензим који везује липопротеине одговоран за смањење нивоа оксидативног стреса у циркулацији (58, 59). Прекурсор алфа-1-микроглобулина/бикунина (АМБП) је још један значајно смањени маркер васкуларне групе. То је прекурсор транспортера липида бикунина, који је такође укључен у супресију упале и неуролошку заштиту (60, 61).
Упркос разним занимљивим хипотезама, немогућност директног откривања механизама биохемијских болести је добро познато ограничење протеомичке анализе вођене открићем. Стога су неопходна даља истраживања како би се поуздано дефинисали механизми иза ових панела биомаркера. Да би се кренуло ка развоју клиничке анализе засноване на МС, будући правац такође захтева употребу циљаних квантитативних метода за верификацију биомаркера великих размера, као што је селективно или паралелно праћење реакција (62). Недавно смо користили паралелно праћење реакција (63) да бисмо потврдили многе промене протеина ЦСФ описане овде. Неколико приоритетних циљева панела је квантификовано са значајном тачношћу, укључујући ИВХАЗ, АЛДОА и СМОЦ1, који се мапирају у наше панеле синапсе, метаболизма и упале (63). Независна аквизиција података (ДИА) и друге стратегије засноване на МС такође могу бити корисне за верификацију циља. Буд и др. (64) Недавно је показано да постоји значајно преклапање између АД биомаркера идентификованих у нашем скупу података о откривању ЦСФ и независног скупа података ДИА-МС, који се састоји од скоро 200 узорака ЦСФ из три различите европске кохорте. Ове недавне студије подржавају потенцијал наших панела да се трансформишу у поуздану детекцију засновану на МС. Традиционална детекција на бази антитела и аптамера је такође важна за даљи развој кључних АД биомаркера. Због малог обиља ЦСФ-а, теже је открити ове биомаркере коришћењем високопропусних МС метода. НЕФЛ и НРГН су два таква примера биомаркера ЦСФ са малом заступљеношћу, који су мапирани на панел у нашој свеобухватној анализи, али се не могу поуздано открити коришћењем наше јединствене МС стратегије. Стратегије циљања засноване на вишеструким антителима, као што је ПЕА, могу промовисати клиничку трансформацију ових маркера.
Све у свему, ова студија пружа јединствен протеомски приступ за идентификацију и верификацију биомаркера АД ЦСФ заснован на различитим системима. Оптимизација ових маркерских панела у додатним АД кохортама и МС платформама може се показати обећавајућим за унапређење стратификације и лечења АД ризика. Студије које процењују лонгитудинални ниво ових панела током времена су такође критичне за одређивање која комбинација маркера најбоље стратификује ризик од ране болести и промене у тежини болести.
Осим 3 узорка које је копирао ЦСФ, сви узорци ЦСФ коришћени у овој студији прикупљени су под покровитељством Емори АДРЦ или блиско повезаних истраживачких институција. У овим протеомским студијама коришћено је укупно четири сета Емори ЦСФ узорака. Утврђено је да кохорта ЦСФ садржи узорке од 20 здравих контрола и 20 пацијената са АД. ЦСФ копија 1 укључује узорке од 32 здраве контроле, 31 АсимАД појединца и 33 АД особе. ЦСФ копија 2 садржи 147 контрола и 150 АД узорака. Кохорта 4 репликације ЦСФ са више болести укључивала је 18 контрола, 17 АД, 19 АЛС, 13 ПД и 11 ФТД узорака. Према споразуму који је одобрио Одбор за институционалну ревизију Универзитета Емори, сви учесници Емори студије су добили информисани пристанак. Према Смерницама за најбоље праксе Националног института за старење за Алцхајмерове центре из 2014. (хттпс://алз.васхингтон.еду/БиоспецименТаскФорце.хтмл), цереброспинална течност је сакупљена и ускладиштена лумбалном пункцијом. Контролни и АсимАД и АД пацијенти добили су стандардизовану когнитивну процену на клиници за когнитивну неурологију Емори или Гоизуета АДРЦ. Њихове узорке ликвора тестирао је ИННО-БИА АлзБио3 Луминек за ЕЛИСА Аβ1-42, укупну тау и п-тау анализу (65). ЕЛИСА вредности се користе као подршка дијагностичкој класификацији субјеката на основу утврђених критеријума искључења биомаркера АД (66, 67). Основни демографски и дијагностички подаци за друге дијагнозе ЦСФ (ФТД, АЛС и ПД) такође се добијају од Емори АДРЦ или повезаних истраживачких институција. Сажети метаподаци случаја за ове случајеве Емори ЦСФ могу се наћи у табели С1А. Карактеристике кохорте 3 репликације Свисс ЦСФ-а су раније објављене (45).
ЦСФ је пронашао узорак. Да би се повећала дубина нашег открића скупа података о ЦСФ-у, имунолошка потрошња протеина велике количине је изведена пре трипсинизације. Укратко, 130 μл ЦСФ из 40 појединачних узорака ЦСФ и једнака запремина (130 μл) Хигх Селецт Топ14 Абунданце Протеин Деплетион Ресин (Тхермо Фисхер Сциентифиц, А36372) стављени су у спин колону (Тхермо Фисхер Сциентифиц, А89868) у просторији температура Инкубирајте). Након центрифугирања у трајању од 15 минута, центрифугирајте узорак на 1000 г током 2 минута. 3К ултрацентрифугални филтер уређај (Миллипоре, УФЦ500396) је коришћен за концентрисање узорка ефлуента центрифугирањем на 14.000 г током 30 минута. Разблажите све запремине узорка до 75 μл са фосфатним пуфером. Концентрација протеина је процењена методом бицинхонинске киселине (БЦА) према протоколу произвођача (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Имуно осиромашен ЦСФ (60 μл) из свих 40 узорака је дигестиран лизил ендопептидазом (ЛисЦ) и трипсином. Укратко, узорак је редукован и алкилован са 1,2 μл 0,5 М трис-2(-карбоксиетил)-фосфина и 3 μл 0,8 М хлороацетамида на 90°Ц током 10 минута, а затим соникиран у воденом купатилу 15 минута. Узорак је разблажен са 193 μл 8 М уреа пуфера [8 М уреа и 100 мМ НаХПО4 (пХ 8,5)] до коначне концентрације од 6 М урее. ЛисЦ (4,5 μг; Вако) се користи за варење преко ноћи на собној температури. Узорак је затим разблажен до 1 М урее са 50 мМ амонијум бикарбоната (АБЦ) (68). Додајте једнаку количину (4,5 μг) трипсина (Промега), а затим инкубирајте узорак 12 сати. Закисели дигестирани раствор пептида до коначне концентрације од 1% мравље киселине (ФА) и 0,1% трифлуоросирћетне киселине (ТФА) (66), а затим одсолите са 50 мг Сеп-Пак Ц18 колоне (Воде) као што је горе описано (25) . Пептид је затим елуиран у 1 мл 50% ацетонитрила (АЦН). Да би се стандардизовала квантификација протеина у серијама (25), аликвоти од 100 μл из свих 40 ЦСФ узорака су комбиновани да би се добио мешовити узорак, који је затим подељен у пет узорака глобалног интерног стандарда (ГИС) (48). Сви појединачни узорци и комбиновани стандарди суше се помоћу вакуума велике брзине (Лабцонцо).
ЦСФ копира узорак. Даион и његове колеге су раније описали осиромашење имунитета и варење узорака копије 3 ЦСФ (45, 46). Преостали реплицирани узорци нису били индивидуално осиромашени. Сварите ове неуклоњене узорке у трипсину као што је претходно описано (17). За сваку поновљену анализу, аликвоти од 120 μл елуираног пептида из сваког узорка су спојени и подељени у аликвоте једнаке запремине који ће се користити као глобални интерни стандард обележен ТМТ (48). Сви појединачни узорци и комбиновани стандарди суше се помоћу вакуума велике брзине (Лабцонцо). Да би се побољшао сигнал ЦСФ протеина мале количине ЦСФ, комбиновањем 125 μл из сваког узорка, припремљен је „побољшани“ узорак за сваку реплицирану анализу [тј., биолошки узорак који имитира истраживачки узорак, али доступна количина је много већи (37, 69)] спојен у мешовити узорак ЦСФ (17). Мешани узорак је затим имунореклоњен коришћењем 12 мл Хигх Селецт Топ14 Абунданце Протеин Ремовал Ремовал Ресин (Тхермо Фисхер Сциентифиц, А36372), дигестиран као што је горе описано и укључен у накнадно вишеструко обележавање ТМТ.
Време објаве: 27.08.2021